Vad är en polymeraskedjereaktion (pcr)? fakta om test, steg & används för

Vad är PCR (polymeraskedjereaktion)?

Polymeraskedjereaktion (PCR) är en teknik som används för att förstärka spårmängder DNA (och i vissa fall RNA) belägen i eller på nästan vilken vätska eller yta där DNA-strängar kan deponeras. Nyckeln till att förstå PCR är att veta att varje människa, djur, växt, parasit, bakterie eller virus innehåller genetiskt material såsom DNA (eller RNA) -sekvenser (nukleotidsekvenser eller bitar av DNA eller RNA) som är unika för deras arter, och till den enskilda medlemmen av den arten. Följaktligen, om ett prov innehåller segment av DNA eller RNA, är PCR en metod som används för att förstärka (göra många fler identiska kopior) av dessa unika sekvenser så att de sedan kan användas för att bestämma med mycket stor sannolikhet källans identitet (a specifik person, djur eller patogen organisme) av spår-DNA eller RNA som finns i eller på nästan vilket material som helst.

PCR-förstärkning är dock bara en del av det identifierande testet. När förstärkningen är klar (se nedan) måste de förstärkta segmenten jämföras med andra nukleotidsegment från en känd källa (till exempel en specifik person, djur eller patogen organisme). Denna jämförelse av unika segment görs ofta genom att placera PCR-genererade nukleotidsekvenser bredvid kända nukleotidsekvenser från människor, patogener eller andra källor i en separerande gel. Elektrisk ström körs genom gelén och de olika nukleotidsekvenserna bildar band som liknar en "stege" beroende på deras elektriska laddning och molekylstorlek. Detta kallas gelelektrofores. Band eller "stege" som steg som migrerar till samma nivåer i gelén visar identiteten hos nukleotidsekvenser. Denna metod är ett av de mest populära sätten PCR-test genomförs (se fig 1).

Figur 1, band eller "stege" som steg av PCR producerat DNA av Mycobacterium (med tillstånd av CDC)

Figur. Repetitive element (Rep) –PCR (A) och pulsed field gel elektrofores (PFGE) (B) mönster av Mycobacterium cosmeticum isolat från 2 patienter i Ohio och 1 patient i Venezuela. Rep-PCR utfördes med användning av BOXA1R-primer (3), och PFGE utfördes med restriktionsenzym AseI. Spår 1, 2, Ohio isolerar OHl och OH2; spår 3, 4, kontrollstammar ATCC BAA-878T och ATCC BAA-879; spår 5, venezuelansk isolering VZ1. DNA-storlekskrav är 100 bp (S1) och 48, 5 kb markör (S2).

Hur görs PCR (polymeraskedjereaktion)?

1983 räknade Kary Mullis ut de grundläggande stegen för att förstärka DNA-sekvenser. Han och Michael Smith tilldelades Nobelpriset för att utveckla detta förfarande 1993. Det finns några grundläggande steg som följs i följd; PCR kan göras i ett enda rör med lämpliga kemikalier och en speciellt designad värmare. Reagensen eller kemikalierna som krävs är följande:

• Ett prov som innehåller en nukleotidsekvens (från blod, hår, pus, skrapning av huden, etc.)
• DNA-primrar: kort enkelsträngat DNA som fästs vid nukleotidsekvenser som främjar syntes av en komplementär sträng av nukleotider
• DNA-polymeras: ett enzym som, när DNA har en primer bundet, går ner i DNA-segmentet som fäster DNA-byggstenar för att bilda komplementära baspar och således syntetiserar en komplementär nukleotidsträng av DNA (införandet av ett värmebeständigt DNA-polymeras, Taq polymeras, härrörande från värmebeständiga bakterier, förbättrade markant förmågan att utföra PCR)
• Ett stort överskott av DNA-byggstenar benämnda nukleotider (Adenin, Thymidine, Cytosine och Guanine, förkortat: A, T, C respektive G) är närvarande i lösningen. När dessa block är sammanlänkade bildar de en nukleotidsekvens eller en enda DNA-sträng. När dessa byggstenar binder deras komplementära byggsten av svaga vätebindningar (till exempel kommer A endast att bindas med T och G endast med C) bildas en komplementär DNA-nukleotidsekvens och binds till det ursprungliga enkelsträngade DNA. När bindningen är klar bildas ett komplementärt dubbelsträngat DNA i en specifik sekvens.

PCR börjar sedan med ett segment av DNA från ett prov som placeras i ett rör med reagensen listade ovan. Lösningen upphettas till minst 94 ° C (201, 2 F); denna värme bryter vätebindningarna som gör det möjligt att bilda komplementära DNA-strängar, så det finns bara enstaka strängar i blandningen (detta kallas denaturering av dubbelsträngat DNA).

Blandningen får svalna till cirka 54 ° C. Vid denna temperatur binder DNA-primrarna och DNA-polymeraset till individuellt enkelsträngat DNA (detta kallas härdning av DNA). Eftersom byggstenarna är i överskott (hög koncentration) i blandningen använder polymeraset dem för att skapa nya komplementära DNA-strängar (benämnd förlängning av DNA) och denna process är snabbare vid 72 ° C (161, 6 F). Denna process skapar en ny dubbelsträngad DNA-molekyl från var och en av de enskilda trådarna i den ursprungliga molekylen.

Denna cykel upprepas ungefär 40 gånger i en maskin benämnd en termisk cykler som automatiskt upprepar uppvärmningskylningscyklerna, varvid mängden av varje DNA-sekvens fördubblas varje gång värmekylningscykeln är avslutad. Det som ursprungligen var ett enda kort segment av DNA kan förstärkas till cirka 100 miljarder exemplar efter 40 fördubblingscykler.

Varför skulle en läkare beställa ett PCR-test (polymeraskedjereaktion)?

PCR-testet utgör grunden för ett antal tester som kan besvara många olika medicinska frågor som hjälper läkare att diagnostisera och behandla patienter. PCR-test kan till exempel upptäcka och identifiera patogena organismer hos patienter, särskilt de som är svåra att odla (till exempel HIV och andra virus och vissa svampar).

Andra läkare beställer PCR-test för att diagnostisera genetiska sjukdomar, medan andra läkare använder PCR för att upptäcka biologiska förhållanden som att identifiera föräldrar till barn. PCR-test används också för att identifiera och karakterisera genetiska mutationer och omarrangemang som finns i vissa cancerformer.

Men PCR-test har modifierats och utvidgats till många aspekter av vetenskapliga undersökningar inklusive evolutionär biologi, genetisk fingeravtryck, kriminaltekniska undersökningar och många andra.

Vad är RT-PCR?

RT-PCR är ett PCR-test som är utformat för att detektera och mäta RNA. Även om initiala PCR-tester förstärkte DNA, använder många virus och andra biologiska komponenter (till exempel mitokondrier) RNA som deras genetiska material. RT-PCR skiljer sig från konventionell PCR genom att först ta RNA och omvandla RNA-strängen till en DNA-sträng. Detta görs med väsentligen samma metod för PCR som beskrivits ovan, med undantag av att använda ett enzym benämnt omvänt transkriptas istället för DNA-polymeraset. Det omvända transkriptaset tillåter en enda RNA-sträng att översättas till en komplementär DNA-sträng. När denna reaktion inträffar kan den rutinmässiga PCR-metoden sedan användas för att amplifiera DNA: t. RT-PCR har använts för att detektera och studera många RNA-virus.

RT-PCR bör inte förväxlas med en annan variant av PCR, benämnd Real-Time PCR. Realtid PCR är en variation av PCR som möjliggör analys av det amplifierade DNA under de vanliga 40 cyklerna av proceduren. Även om proceduren liknar konventionell PCR med cykling, använder Real-Time PCR fluorescerande färgämnen fästa vid några av byggstenarna eller små nukleotidsträngar. Beroende på vilken metod som används uppstår fluorescens när de amplifierade DNA-strängarna bildas. Mängden fluorescens kan mätas genom de 40 cyklerna och gör det möjligt för utredarna att mäta specifika produkter och deras mängder under amplifieringscyklerna. Detta tillåter ofta utredare eller laboratorietekniker att hoppa över gelelektrofores eller andra sekundära förfaranden som behövs för analys av PCR-produkterna, vilket ger snabbare resultat.

PCR och RT-PCR i realtid är variationer eller modifieringar av det ursprungliga PCR-testet. Det finns dock många fler variationer (minst 25) som finns och används för att lösa specifika problem. De har alla olika namn som Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-fas PCR och många andra.

PCR kommer sannolikt att fortsätta att modifieras för att hjälpa till att svara på andra frågor inom medicin, biologi. och andra studierektorer.